东京工业大学科学技术创成研究院北口哲也副教授和生命理工学院研究生伊藤良浩等人组成的研究团队与味之素公司共同开发出了一种可快速制作高分泌生产生物医药品的有用蛋白质微生物菌株的新型高通量筛选方法。相关成果已发表在《Small》在线版上。
图1.使用微滴培养和生物传感器Q-body的蛋白质高分泌生产菌株筛选方法示意图（供图：东京工业大学）
（a、b）将含有分泌目标蛋白的微生物及Q-body的溶液倒入微流路，并用油（Oil）剪切，制备Water-in-Oil（油包水）乳剂
（c）在乳剂中培养微生物，用分泌生产生物传感器通过荧光检测出目标蛋白
（d）为了防止筛选过程中的乳剂破损，将乳剂倒入微流路，制备受油层保护的Water-in-oil-in-water（水包油包水）乳剂
（e）以荧光强度为指标筛选和回收分泌目标蛋白的乳剂
在生物医药品的制造中，利用微生物分泌生产蛋白质的方法因其成本低、不含动物来源成分等优点而被广泛应用。另一方面，制作高水平分泌生产蛋白质的工业用微生物菌株需要导入多个有助于蛋白质分泌生产的基因改造，因此存在开发周期长的问题。
作为在短时间内对大规模基因改造微生物菌株库进行培养评估的方法，研究团队着眼于将W/O/W（Water-in-oil-in-water，水包油包水）乳剂（微滴的一种）作为培养反应器的超并列培养。研究了在直径约30微米的乳剂中逐株封入基因改造微生物菌株，在乳剂内进行菌体增殖、目标蛋白的分泌生产，并选择回收蛋白质分泌生产能力提高的菌株的筛选方法。使用淬灭抗体Q-body作为检测乳剂内分泌的目标蛋白的方法。Q-body由荧光标记的抗体片段构成，当与作为抗原的蛋白质结合时，荧光强度因抗原浓度依赖性迅速增加，因此有望用作乳剂培养的生物传感器。
研究团队首先验证了是否可以在乳剂中使用Q-body检测目标蛋白浓度的变化。作为检测生长因子一种的人FGF9（重组人成纤维细胞生长因子9）的生物医药品的模型，准备了各种浓度的融合了Q-body响应肽序列的FGF9，与荧光染料TAMRA修饰scFv型Q-body一起封入乳剂中，通过流式细胞仪分析了荧光强度。在FGF9摩尔浓度为10-1000纳米摩尔的范围内，观察到浓度依赖性荧光强度上升，表明在乳剂中使用Q-body检测蛋白质是可能的。
其次，研究团队将分泌生产该FGF9的革兰氏阳性菌Corynebacterium glutamicum及不分泌FGF9的阴性对照菌株与Q-body一起封入乳剂中进行培养，并用细胞分选仪研究了FGF9分泌生产菌株能否以荧光为指标选择性回收。结果发现FGF9分泌生产菌株封入乳剂的荧光强度明显高于阴性对照菌株封入乳剂，通过用Q-body对分泌的FGF9进行荧光检测，成功地仅回收了FGF9分泌生产菌株。
此外，针对FGF9分泌生产菌株，构建了包括用化学诱变剂 N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍诱变的超过10 7个突变菌株的库，其中约10 5个变异株在乳剂内培养，并证实了可以用细胞分选仪选择性回收显示出高荧光强度的约前50株。对筛选获得的变异株群进行培养评估后得出，与变异处理前相比，FGF9分泌产量明显提高，并成功获得了相对于非变异处理株，分泌量最大增加约3倍的菌株。
由此，迅速筛选现有方法无法实现的庞大菌株库成为可能，并证明了使用微滴培养和Q-body的蛋白质高分泌生产菌株筛选方法的有效性。
通过此次开发的方法，能够快速制作近年来需求增加的生物医药品的工业用微生物菌株，且有望在数年内实现各种生物医药品的低价供给。据研究团队介绍，今后，在促进生物医药品研究开发的实际应用的同时，还会向生物医药品以外的有用蛋白质横向展开。另外，作为检测精度更高的生物传感器，将进一步探讨利用福斯特共振能量转移的Q-body等提高筛选方法的效率和精度。
原文：《科学新闻》
翻译：JST客观日本编辑部
【论文信息】
杂志：Small
论文：Efficient Microfluidic Screening Method Using a Fluorescent Immunosensor for Recombinant Protein Secretions
DOI：10.1002/smll.202207943
