东京工科大学应用生物学部的吉田亘副教授和松井彻教授等人组成的研究团队，成功开发出了只需混合试剂即可简单、快速地测量有望作为癌症和中枢神经系统疾病生物标志物使用的基因组DNA羟甲基化水平的方法。
有报告显示，DNA去甲基化反应的中间产物5-羟甲基胞嘧啶可作为阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病的生物标志物使用，但一直没有简单易行的测量方法。研究团队此前开发了使用甲基CpG结合蛋白融合荧光素酶测量基因组DNA的甲基化CpG水平的方法。此次则利用了在与基因组DNA结合的DNA嵌入剂和甲基CpG结合蛋白融合荧光素酶之间发生的生物发光共振能量转移现象。
为测量羟甲基化水平，研究团队着眼于羟甲基化CpG结合蛋白UHRF2的SRA结构域。首先，重组生成了在UHRF2 SRA中融合源自萤火虫的发光蛋白荧光素酶的蛋白质（UHRF2 SRA-Fluc）。UHRF2 SRA不仅与羟甲基化CpG结合，还与甲基化CpG结合，因此研究团队为抑制UHRF2 SRA与甲基化CpG结合，还重组生成了甲基化CpG结合蛋白MBD。
图1：基因组中的5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶
此类修饰含氮碱基的异常状态有望被用作检测癌症与中枢神经系统疾病的生物标志物。（供图：东京工科大学）
接下来结合DNA嵌入剂和MBD制备了人类基因组DNA，并添加UHRF2 SRA-Fluc和萤光素酶发光基质。结果显示，UHRF2 SRA-Fluc在人类基因组DNA中的羟甲基化CpG位点发光，并激发附近的嵌入剂。另外还发现，其荧光强度取决于人类基因组DNA的羟甲基化水平。
研究团队由此确认，只需在靶基因组DNA中混合UHRF2 SR-Fluc、MBD、嵌入剂及荧光素酶发光基质，并测量荧光强度，即可在40分钟内测量出羟甲基化水平。
图2：人类基因组内5-羟甲基化修饰频率检测法的检测原理
UHRF2 SRA-Fluc与CpG序列羟甲基化的结合与接近，将荧光素酶所产生的能量转移到相邻DNA分子荧光探针，使其发出发射光。所有反应可在一个反应体系内同时进行，因此只需将所有物质混合就可达成检测。（供图：东京工科大学）
吉田副教授表示：“这种方法的优点是，构建识别特定修饰碱基的蛋白质与荧光素酶的融合蛋白，就可以在同一平台上测量修饰碱基。另外，融合最大发光波长不同的荧光素酶还可以同时测量多个修饰碱基。今后将开发测量各种修饰碱基的方法，并确立与这些修饰碱基状态异常有关的疾病的诊断方法。”
【词注】
■羟甲基化：甲基胞嘧啶被甲基胞嘧啶氧化酶氧化生成羟甲基胞嘧啶的反应。
■CpG：由胞嘧啶与鸟嘌呤的连续碱基序列构成的DNA。
原文：《科学新闻》
翻译编辑：JST客观日本编辑部
【论文信息】
期刊：Analytical Chemistry
论文：Quantification of global DNA hydroxymethylation level using UHRF2 SRA-luciferase based on bioluminescence resonance energy transfer
URL：pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.1c05619
