日本理化学研究所（简称理研）BDR（Center for Biosystems Dynamics Research）中心的金坚石博士和城口克之教授等与京都大学合作，成功开发出了名为BarBIQ（Barcoding Bacteria for Identification and Quantification）的高通量菌群分析新技术。该技术基于16S rRNA基因测序和单细胞标签等技术，实现了对菌群中单细胞（细菌个体）的精确鉴定和细胞数的定量，对单细胞中16S rRNA序列的鉴定可以同时达到单碱基正确率和单碱基分辨率，是目前唯一可以同时做到既见“森林”（菌群整体）又见树木（细菌个体）的菌群分析方法，开创了菌群研究领域的先河（图1）。该技术未来可用于肠内菌群相关疾病的理解和诊断，还可以高精度测量皮肤、口腔、植物、土壤、海洋以及大气中存在的菌群，具有广泛的科学用途。相关内容已经发布在《Nature Communications》在线版上（2月22日）。
图1 单细胞菌群分析方法示意图
人类的肠道居住着约500～1000种细菌，近100万亿个细菌，这种细菌组成的群体被称为“菌群”。肠内菌群的平衡与肠内免疫以及健康密切相关，所以准确测量各种细菌的分布情况是极为重要的。此次，该研究团队将细菌逐一封入液滴，并对每个细菌的16S rRNA基因标记上不同的被称为条形码的DNA序列，从而实现了一次性对10万个以上的细菌的种类的鉴定和各种类细菌的定量。利用这种方法，他们精确测定了小鼠经维他命A缺乏食物喂养后其盲肠内菌群的微小变化。
BarBIQ方法是在城口克之等人先后于2012年和2017年发表的DNA分子条形码标记法基础上开发成功的。该方法将菌群中的细菌单细胞一个个封装入液滴，并在DNA扩增中对每个细菌细胞的16S rRNA基因标记上唯一的DNA系列（这种策略也被称为细胞条形码标记）。具体操作如下。
① 菌群中的细菌单细胞和一个具有唯一序列的单分子DNA（细胞条形码）被共封装入液滴 （图2）。
图2 BarBIQ法示意图
② 细菌中的16S rRNA基因被扩增并和同一液滴中的细胞条形码相连接。因此不管来自同一个细菌的16S rRNA基因有多少个或者多少种，都将被标记上相同的细胞条形码（图2）。这是实现单细胞分析的关键步骤。
③ 液滴中所有被扩增的DNA被纯化和二代测序分析后，16S rRNA基因序列和细胞条形码会被成对读出。之后，16S rRNA基因序列被用来鉴定细菌的种类，而细胞条形码则被用来确定这些16S rRNA基因序列来自哪个细胞。
图3 BarBIQ法与传统方法的比较
16S rRNA基因在不同种类细菌中具有不同的序列，因此被广泛用来鉴定细菌的种类。BarBIQ方法在DNA扩增时，每个细菌细胞都被隔离在一个液滴中，因此不同细菌的16S rRNA基因不会被嵌合扩增成不准确的DNA产物，而大量扩增出来的DNA嵌合体正是造成传统方法鉴定16S rRNA序列不准确的主要原因之一。
另外，BarBIQ方法中每个细菌被不同的细胞条形码标记，所以哪怕只有一个碱基不同的16S rRNA序列，也能被鉴别出是来自不同细菌的还是来自同一细菌的相似序列。因此，BarBIQ方法相比于传统方法，首次实现了基于细胞的16S rRNA序列鉴定，同时还具有单碱基准确率和单碱基分辨率（图3）。
此外，因为每个细菌个体都是被不同细胞条形码标记的，即使是相同的细菌也能通过被标记的条形码区分开，因此BarBIQ方法可一次性鉴定超过10万个细菌的种类还能对每一种鉴定细菌进行细胞计数。而传统方法无法追踪每个细胞，因此只能实现对被扩增16S rRNA分子的鉴定和计数（图3）。
图4 封入细菌的液滴
左为刚做好的液滴明场显微镜图像；右为液滴中细菌DNA经荧光染色后的荧光图像。箭头所指处为观察到的细菌
论文：
Jianshi Jin, Reiko Yamamoto, Tadashi Takeuchi, Guangwei Cui, Eiji Miyauchi, Nozomi Hojo, Koichi Ikuta, Hiroshi Ohno, Katsuyuki Shiroguchi, High-throughput identification and quantification of single bacterial cells in the microbiota, Nature Communications (2022) doi.org/10.1038/s41467-022-28426-1.
文 曹晖 JST客观日本
