本文根据大阪大学研究成果编译而成
大阪大学研究生院医学系研究科干细胞应用医学领域的捐赠讲座教授林龙平、眼科学先导性跨学科研究机构生命医科学融合前沿研究部门的教授西田幸二与眼科学干细胞应用医学领域的特任研究员能美君人等人组成的研究团队，在日本医疗研究开发机构（AMED）的支援下，确立了利用人iPS细胞培养具有粘液素分泌功能的功能性结膜上皮的新方法。
眼球表面由角膜和结膜组成，结膜负责维持泪液层，当其功能减弱时，眼球表面会变得干涩，从而发生干眼症等疾病。研究团队此前曾成功利用人iPS细胞诱导了角膜上皮，但一直不清楚诱导结膜上皮的方法。
此次研究团队发现，通过用利用人iPS细胞诱导的二维眼类器官激活EGF受体信号，选择性诱导结膜细胞。对利用细胞分选仪分离出来的iPS细胞源结膜上皮祖细胞进一步进行成熟培养发现，要想分化为结膜上皮和杯状细胞，需要添加KGF（图1）。
图1：研究概要
含有利用人iPS细胞诱导的各种眼部细胞的类器官——自发形成的外胚层多重区域（SEAM）的Zone 3存在眼表上皮祖细胞。在分化培养中，EGF促进分化为结膜上皮祖细胞，KGF促进分化为角膜上皮祖细胞。另一方面，结膜上皮祖细胞向结膜上皮及杯状细胞成熟分化时需要添加KGF。
利用该研究成果能大量得到此前难以培养的人眼结膜细胞，在针对干眼症等的新药研究和再生医疗研究方面有望取得重大进步。
研究背景
眼球表面主要由结膜上皮和角膜上皮组成，角膜覆盖在黑眼球部分，结膜覆盖在眼睑内侧和眼球表面至黑眼球周围的部分。这些部分必须相互配合工作才能有良好的视力。结膜上皮的重要作用是通过向泪液中分泌粘液素（MUC5AC等）来保护眼球表面。如果疾病或炎症等导致结膜的粘液素分泌功能减弱，眼球表面会变得干涩，从而发生干眼症。但与角膜上皮相比，结膜上皮的研究比较落后，因为很难获得人结膜细胞，而且也一直未能确立结膜细胞的培养方法。
研究团队此前曾确立了利用人iPS细胞诱导含有各种眼细胞的类器官——自发形成的外胚层多重区域（Self-formed Ectoderm Autonomous Multi-zone：SEAM，图2）的方法，利用SEAM成功培养了角膜上皮组织。但一直不清楚同为眼表上皮的结膜上皮的分化诱导法。另外，以往的报告表明，EGF与结膜上皮、KGF与角膜上皮的表型维持和增殖有关，但不清楚这些生长因子对发育过程的具体影响。
图2：SEAM的模式图
SEAM形成了同心圆状的4层结构，角膜和结膜的上皮原基——眼表外胚层在Zone 3发育。
因此，本研究的目标是，通过在适当条件下区分使用EGF和KGF，从SEAM诱导、分离和成熟结膜细胞。
研究成果
研究团队首先比较研究了利用人iPS细胞形成SEAM后添加EGF或KGF时的变化。开始诱导分化6周后，添加EGF的SEAM（+EGF）和添加KGF的SEAM（+KGF）均在SEAM的zone 3诱导出了p63+/PAX6+眼表上皮原基（角膜和结膜上皮的原基）。另一方面，开始诱导分化10周后，添加KGF时像此前报告的一样诱导出了角膜上皮，而添加EGF会强烈抑制向角膜上皮细胞分化（图3A–B）。这些结果表明，添加EGF会抑制SEAM中的角膜上皮分化，诱导结膜上皮细胞。
图3：添加EGF的SEAM抑制向角膜上皮细胞分化
A：添加EGF的SEAM（+EGF）和添加KGF的SEAM（+KGF）的免疫染色。添加EGF的SEAM在开始诱导分化10周后，抑制了角膜上皮细胞标志物K12的表达。
B：添加EGF的SEAM和添加KGF的SEAM的基因表达分析。与免疫染色结果一样，添加EGF的SEAM中，角膜上皮细胞标志物（K12、K3）的表达显著下降（p<0.01）。
接下来，研究团队利用分离和分析眼表上皮细胞时使用的3种细胞表面标志物（CD200、SSEA-4、ITGB4）对添加EGF的SEAM进行染色，然后利用荧光激活细胞分选术（FACS）将其分为6部分，详细进行了分析（图4A）。由此发现，CD200阴性/SSEA-4弱阳性/ITGB4阳性区域（P2）的细胞在刚刚分离后不表达结膜分化标志物，但通过进行多层化培养，会分化成含结膜杯状细胞的成熟结膜上皮。有趣的是，进行成熟培养时，在添加KGF而非EGF的条件下，观察到结膜杯状细胞标志物MUC5AC的表达量升高（图4B–C）。另外还确认，此次研究培养的人iPS细胞源结膜上皮膜具有MUC5AC分泌功能（图4D），在结膜标志物的免疫染色和粘液素染色中也表现出与正常的结膜上皮相同的特征（图4E–F）。
图4：对源自添加EGF的SEAM的结膜上皮祖细胞区域（P2）进行分离，通过用KGF进行成熟培养制作结膜上皮组织
A：添加EGF培养的SEAM（10～12周）的FACS分析及各细胞群的分离。
B：对源自P2及P3区域的上皮细胞进行培养后实施的MUC5A免疫染色。
C：不同培养条件下的MUC5AC阳性细胞数量。
D：通过ELISA测量培养液中的MUC5AC浓度。Control, 仅培养基；ND：Not Detected。
E：人iPS细胞源结膜上皮组织的免疫染色。
F：PAS染色（粘液素染色）。
另外研究团队还发现，不仅是EGF，其他EGF受体配体TGF-α和Amphiregulin也能诱导分化结膜上皮祖细胞。
如上所述，此次的研究表明，EGF等的EGF受体介导的信号对通过人iPS细胞分化结膜上皮类细胞（结膜上皮细胞、杯状细胞、祖细胞）非常重要，研究团队结合SEAM法成功诱导了结膜上皮细胞。另外，研究团队还利用KGF成功培养了此前难以培养的具有杯状细胞的功能性结膜上皮。本研究表明，EGF等的EGF受体配体对眼表上皮细胞分化为结膜上皮祖细胞、KGF对结膜上皮祖细胞成熟为结膜上皮至关重要。
利用此次的研究成果可以通过iPS细胞诱导分化此前难以获得的人结膜细胞，可作为分析结膜和角膜等眼表上皮的功能和明确其发育过程的研究工具利用。此外，还有望用来研究靶向结膜细胞治疗干眼症等眼部疾病的新药，以及作为开发眼表再生治疗法的研究工具使用。
论文信息
题目：Generation of functional conjunctival epithelium, including goblet cells, from human iPSCs
期刊：Cell Reports
DOI：10.1016/j.celrep.2021.108715
日语发布资料
编译：JST客观日本编辑部
