科学研究 - 京都府立医科大学等开发新冠病毒高亲和性中和蛋白制剂

本文根据大阪大学研究成果发布资料翻译整理而成

新型冠状病毒病感染症（COVID-19）肆虐全球，至今仍未找到有效的治疗方法，需要尽快开发治疗药物和疫苗。

京都府立医科大学循环器内科学的星野温助教、大阪大学蛋白质研究所的高木淳一教授及微生物病研究所的冈本彻教授等人组成的研究团队，成功地将新冠病毒的受体——ACE2蛋白的病毒结合力提高了100倍以上。新冠病毒通过与人体细胞ACE2蛋白结合来完成感染，而利用提高了结合力的高亲和性修饰型ACE2蛋白，有望抑制病毒感染人体细胞。

今后将与Life Science Institute公司共同开发采用该高亲和性修饰型ACE2蛋白的病毒中和蛋白制剂。

背景

新型冠状病毒（SARS-CoV-2，简称“新冠病毒”）引起的新型冠状病毒感染症（COVID-19）已在全球造成5000多万人感染，130多万人死亡。新冠病毒通过使病毒颗粒表面的刺突蛋白与人体细胞表面的ACE2蛋白结合来完成感染。因此，治疗时可采用阻断并中和刺突蛋白的方法，作为中和制剂，业界目前正在大力开发抗体制剂。不过，使用抗体制剂的话可能会发生逃逸突变，即因病毒发生基因突变，刺突蛋白的形状改变，导致抗体无法与其结合。为解决这个问题，研究团队着眼于新冠病毒受体——ACE2蛋白，开发通过提高ACE2蛋白与病毒的结合力来实现高中和活性的蛋白制剂。

研究方法与成果

研究团队采用了定向进化法，即在试管内进化ACE2蛋白，使其更容易与病毒结合。首先，在容易出错的条件下扩增ACE2基因，制作拥有约10万种ACE2突变体的基因库。然后在细胞表面分别表达这些突变体，从中回收能与病毒的刺突蛋白充分结合的类型。之后继续向回收的ACE2突变体中导入突变，以同样的流程回收能进一步与刺突蛋白结合的突变体。通过重复这个步骤，最终成功地将ACE2与病毒刺突蛋白的结合力提高到了100倍以上（图1）。作为结合力指标的解离常数（KD值）方面，野生型为41.4nM ，而修饰型ACE2为0.37nM，实现了比抗体制剂更高的结合力。

图1：利用定向进化法开发高亲和性ACE2的概要

接下来，研究团队合成了使抗体的Fc区域与该高亲和性修饰型ACE2结合的蛋白制剂，并评估了功能。通过结合Fc，有望稳定在体内的药代动力学特性，以及变成二聚体提高中和活性。在针对伪病毒的中和实验中，野生型的感染半抑制浓度（IC50）为12.6μg/mL，而修饰型为0.055μg/mL，有效性约达到200倍。另外，在针对新冠病毒的中和实验中，修饰型ACE2-Fc在普通抗体制剂的血液浓度范围内表现出良好的病毒中和活性（图2）。

图2：修饰型ACE2-Fc制剂的病毒中和试验

在伪病毒中和试验中，研究团队使不同浓度的ACE2-Fc和病毒分别与293T/ACE2细胞反应1个小时，48小时后利用荧光素酶检验法评估了感染率（左侧）。而在新冠病毒中和试验中，使不同浓度的ACE2-Fc和病毒分别与Vero6/TMPRSS2细胞反应2个小时，24小时后利用实时PCR法评估了分泌到培养基中的病毒拷贝数（右侧）。