客观日本

京都大学利用人iPS细胞制作可长期保持高纯度的心室肌细胞

2020年11月25日 生物医药

本文根据京都大学成果发布资料整理而成

日本京都大学iPS细胞研究所CiRA增殖分化机构研究部门山下润教授等人组成的研究团队,开发出了利用人iPS细胞制作可长期保持高纯度的心室肌细胞的新技术。

源自人iPS细胞的心肌细胞有望用于心脏毒性筛查、新药开发和疾病建模等多种用途。因此,稳定制作高纯度人iPS细胞源心肌细胞的需求逐渐高涨。但目前的人iPS细胞源心肌细胞制作方法,无法将人iPS细胞全部分化成心肌细胞,因此,为了确保高纯度的心肌细胞,还要在制作的最终阶段进行纯化。另外还知道,利用这些方法制作的心肌细胞中混合了多种性质的细胞,比如活体的心室肌细胞样细胞、心房肌细胞样细胞和起搏器细胞样细胞等。

山下教授的研究团队以此前的心肌分化诱导法为基础,诱导并收集了能分化为心肌细胞的中胚层细胞群(血小板源生长因子受体-α(PDGFRα)阳性细胞),然后利用两种Wnt信号抑制剂(XAV及IWP4)根据分化阶段选择性地施加刺激,将其强力诱导为心肌细胞,由此成功制作了高纯度的心肌细胞(图1)。

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图1:利用人iPS细胞制作高纯度心室肌细胞的方法
诱导并收集中胚层细胞群(血小板源生长因子受体-α(PDGFRα)阳性细胞),利用两种Wnt抑制剂(XAV及IWP4)进行强力刺激,使其分化为心肌细胞,由此制作了心室肌细胞。

这种改善过的心肌细胞制作方法不仅能稳定获得高纯度的心肌细胞,而且在省去心肌细胞纯化步骤的情况下,在200天以上的长时间培养中还能保持高纯度状态(图2)。另外,这些心肌细胞大多都表达心室肌的特异性标志物——肌球蛋白轻链(MLC)2v,随着进行长时间的培养,其表达变得更加特异性(图3)。此外,长时间培养的心室肌细胞表现出横纹(肌节)结构成熟(形成Z带和M带等,肌节长度增加)以及线粒体增加并成熟的特征,还具有成熟个体的成熟心肌细胞结构——T管样结构(图4)。在电生理学方面也表现出心室肌细胞成熟的特征,即最大舒张电位(MDP)降低,电位峰值(Peak)、动作电位幅值(APA)和动作电位(AP)最大上升速度(dV/dtmax)升高(图5),对表示QT延长的药剂也表现出与活体心室肌相同的反应。

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图2:高纯度心室肌细胞的长时间培养
制作高纯度心室肌细胞后(d21),即使在省去纯化步骤的情况下进行200天以上的长时间培养(d201),也依然能保持高纯度。

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图3:长时间培养的高纯度心室肌细胞
肌球蛋白轻链(MLC)2a(绿色)和肌球蛋白轻链(MLC)2v(红色)。
MLC 2v在心室肌特异性表达。而MLC 2a在心房肌及未成熟的心肌中表达。
表达MLC2v的心室肌样细胞特异性分化。

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图4:长时间培养的心肌细胞的电子显微镜观察结果(培养第231天)
A:可以看到成熟的横纹结构和线粒体。B:可以看到T管样结构。
比例尺: 1μm(A), 400nm(B)

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图5:高纯度心室肌细胞的电生理学成熟
分别显示了最大舒张电位(MDP)、电位峰值(Peak)、动作电位幅值(APA)及动作电位最大上升速度(dV/dtmax)。随着心室肌细胞逐渐成熟,会出现MDP降低以及Peak、APA和dV/dtmax升高的现象。

论文信息
题目:Specific induction and long-term maintenance of highpurity ventricular cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells
期刊:PLOS ONE
URL:journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0241287

日语发布原文

编译:JST客观日本编辑部