理化学研究所（理研）生命机能科学研究中心集成生物元件研究团队的田中阳首席研究员、太田亘俊研究员，与北海道大学的与那岭雄介助教、东京大学大学院的小关泰之副教授、九州大学的星野友准教授等组成的联合研究小组，通过精巧设计的“水坝型”微流体玻璃芯片，成功对可泳动微生物在芯片微通道中进行了分离和培养，并对每一个细胞的长时间观察来实现了多个细胞代谢产物的测定 [1]。
基于该技术，对以前难以持续观察的快速泳动型微生物的示踪变得可能，同时也可以用于生物燃料、营养补充剂、生物药等特定次级代谢产物生产用途的微生物筛选等（图1）。该研究成果已在线发表于2019年7月8日的《Analytical Chemistry》上[文献1]。
图1 玻璃微流体芯片中实现单细胞分离、培养和观察
在同一类微生物群体中，不同个体间产生某种目的代谢产物的能力差异性极大。所以在研究实验室或者工业生产中，往往需要先富集筛选出能够产生某种目的代谢产物的高产菌株（细胞株）。目前针对不同微生物和不同目的次级代谢产物，有各种各样的筛选方法。其中非侵入性检测代谢产物的拉曼光谱法，是对细胞内代谢产物变化实时观测的重要手段之一。
代谢分析一般需要将单个细胞一一捕获，然后在其生长期间进行；尤其对于那些运动快速的微生物，还需要保证其在重复观测期间不能跟丢。如果为了便于追踪简单的将被观测微生物封闭在狭小的空间内，由于缺乏新鲜的细胞培养液供给，往往会导致个体代谢异常。所以之前对于具有快速运动能力的微生物很难进行长达数小时的实时观测。
本次研究组选取的实验对象是具有鞭毛能快速游动的单细胞眼虫（Euglena）。眼虫细胞内能够通过光合作用合成生物燃料成分之一--裸藻淀粉（Paramylon）。裸藻淀粉是由成百上千个葡萄糖单体通过β-1,3键结合而成的多糖类物质。当在眼虫细胞内大量合成累积时，可以见到颗粒状的结构体。在厌氧状态下，眼虫会将裸藻淀粉转化成油脂类获取能量。要筛选眼虫中裸藻淀粉的高产株系，必须对每一细胞的裸藻淀粉合成代谢情况进行测定（图2）。
图2 微流体玻璃芯片实物照片
微流体芯片是通过使用半导体制造技术，在树脂或者玻璃等基板上制出精细通道，对液体或者液体中的流动颗粒物进行分离、浓缩、反应、分析等操作的微型集成装置。该研究组先利用玻璃材料制备了0.9毫米厚的微流体芯片，芯片微通道中蚀刻有水坝型的结构。然后通过连续贯流的细胞培养液，行动敏捷的眼虫被逐一截留在坝型结构的边缘并成功持续培养。
为了制备同时能够实现分离与培养功能的坝型结构，研究组首先用氟化氢对0.7毫米厚的玻璃基板进行蚀刻，基板表面形成126条细胞分离用精细通道。坝型结构上方预留了1微米高的间隙用于培养液的更替，最后再贴覆另一层0.2毫米厚的玻璃基板（图3）。通过调整细胞培养液的流速和方向，可以实现精细通道中眼虫的分离及过剩微生物的去除。
图3 微流体玻璃芯片各制作参数
当细胞培养液的流速为每分钟5微升时，眼虫可以在精细通道的末端即坝型结构前截留下来；此时每条通路不多于两个细胞，一枚芯片大约有25-35个眼虫单体被成功分离；然后调整培养液的流速为每分钟1微升连续供给，眼虫得到原位持续培养。进一步结合非侵入性的拉曼光谱分析法，对眼虫胞内产生裸藻淀粉的代谢过程进行了实时测定（图4）。
图4 拉曼光谱法观测分析眼虫体内裸藻淀粉的积聚
供稿 宋傑 东京大学博士
图取自日文新闻发布稿
编辑修改 JST客观日本编辑部
参考文献：
1. Nobutoshi Ota, Yusuke Yonamine, Takuya Asai, Yaxiaer Yalikun, Takuro Ito, Yasuyuki Ozeki, Yu Hoshino and Yo Tanaka. Isolating single Euglena gracilis cells by glass microfluidic for Raman analysis of paramylon biogenesis. Analytical Chemistry. DOI 10.1021/acs.analchem.9b01007
相关链接：
1. 东京大学官网新闻稿
