大阪大学研究生院工学研究科的博士生辻康介、山中真仁特任副教授（全职）、藤田克昌教授，大阪大学先导性跨学科研究机构的熊本康昭副教授等人的研究团队，与大阪大学免疫学前沿研究中心、大阪大学产业科学研究所、京都府立医科大学等机构合作，成功开发出一种可对光学显微镜下正在观察的细胞，在任意时间点以毫秒级时间速度进行冷冻固定，直接对其展开详细观察的“时间决定型冷冻光学显微镜法”。通过掌握直至冻结固定前一刻细胞内“何种现象在何处发生”的细胞动态时空信息，能够以高定量和高空间分辨率实现细胞动态“某一瞬间”的可视化，该技术有望广泛应用于以光学显微镜活体样本观察为基础的生命科学及医学领域研究，并做出贡献。相关成果已发表在期刊《Light: Science & Applications》上。
图1.（上）本研究的技术概念；（下）对荧光显微镜下正在观察的大鼠原代培养心肌细胞内传播的Ca 2+ 波进行急速冷冻固定。细胞中导入了在Ca 2+ 浓度升高时会明亮发光的荧光性Ca 2+ 指示剂。从图中可确认：从细胞左上向右下传播的Ca 2+ 波因急速冷冻而瞬间停止，冷冻前一刻细胞内的Ca 2+ 分布状态得以保留。（图片出自大阪大学新闻发布：https://resou.osaka-u.ac.jp/ja/research/2025/20250824_1 ，客观日本编辑部翻译）
研究团队开发出了一款操作简便的样本冻结腔室，可在以光学显微镜观察细胞的过程中进行急速冷冻固定，并在保持冷冻状态的情况下对样本展开详细观察。在开发的腔室中，为确保足够的冷冻速度，会先减少细胞周围的缓冲液量，然后注入液体异戊烷-丙烷混合冷冻剂（-185℃左右），急速冻结固定样本。注入的混合冷冻剂会直接留在样本上方，急速冷冻后仍能维持低温环境。该腔室可简单地安装在各类市售光学显微镜上，若使用备用腔室部件，进行样本更换也仅需1分钟左右。此外，研究团队还开发出一套通过电动控制，以±10毫秒精度将混合冷冻剂注入样本的冷冻剂滴下装置。
在本次研究中，研究团队利用所开发的样本腔室，成功实现了对细胞内高速传播的钙离子，以及细胞内动态运动的细胞器等的瞬间冻结固定。在钙离子分布冻结后，通过长时间曝光大幅提高了信噪比，证实了冻结后能够以高定量性对细胞进行观察。
此外，研究团队还成功实现了细胞内钙离子分布与肌动蛋白丝的双色超分辨成像，以及细胞内钙离子分布的三维超分辨观察，证明即便是需要相对较长曝光时间的观察技术，也能够可视化细胞的“某一瞬间”。另外，通过利用细胞光刺激技术与电动控制冷冻剂滴下装置，能够以±10毫秒的精度任意决定从细胞内现象发生到冻结固定的时间。
除此之外，研究团队还利用超分辨荧光显微镜和拉曼显微镜对冷冻后的样本进行观察，证实了即便是观察耗时不同的多种光学成像技术（超分辨荧光显微镜的成像时间为750毫秒，拉曼显微镜的成像时间为25分钟），也能对同一时间点的细胞状态进行可视化与分析。研究团队将该技术命名为“时间决定型冷冻光学显微镜法”。
起点在于思路转换
藤田教授表示：“本研究始于一个大胆的思路转换——不受曾是活细胞成像难题的‘时间限制’束缚，而将细胞的动态‘定格观察’。本技术的特点在于，能够在掌握细胞时空信息的同时掌握冻结瞬间的状态，并利用各类光学显微镜技术对其进行详细且高定量性的观察。我们期待该技术能为生物学及医学领域的研究带来新视角，并成为一项基础技术。”
原文：《科学新闻》
翻译：JST客观日本编辑部
【论文信息】
期刊：Light: Science & Applications
论文：Time-deterministic cryo-optical microscopy
DOI：doi.org/10.1038/s41377-025-01941-8
