科学研究 - 【自噬开创的新世界】（二）阐明蛋白质的结构，“液-液相分离”是反应的关键

野田展生
微生物化学研究所结构生物学研究部部长
2013年入选CREST研究代表
（2013～2019年、2020年～）

由联合研究走进不同领域
潜心于自噬现象的阐明

自噬是回收体内蛋白质的循坏系统，它并不会分解一切，它将要分解的物质包裹到名为“自噬体”的脂质膜结构中之后进行分解（图1）。也就是说，自噬体在包裹物质时会区分要分解的物质和不分解的物质。日本微生物化学研究所结构生物学研究部的野田展生部长的研究正在专注于这种自噬体的形成机制。野田还担任CREST“细胞内现象的时空动态”研究领域的“多级高阶结构群驱动的自噬动态”研究的研究代表。

图1：进行自噬时，首先脂质会在细胞中聚集成膜，形成包裹蛋白质和线粒体等细胞器的“自噬体”。自噬体与含有自噬分解酶的“溶酶体”结合，通过这种酶分解被包裹在内部的细胞器等。自噬生成的氨基酸在体内被回收用于抵御饥饿，自噬还可以分解净化进入细胞的细菌和导致功能不良的细胞器等。

野田和自噬的相遇要回溯到博士后时期。博士生时代他的专业X射线晶体结构分析，通过向蛋白质晶体照射X射线调查其构造。取得博士学位后，野田到北海道大学研究生院药学研究科的稻垣冬彦教授（当时）的研究室做了博士后研究员，稻垣教授的研究室当时正在推进在不形成晶体的情况下通过核磁共振（NMR）分析蛋白质结构的研究。

野田回忆当时的情况说：“我想通过分析蛋白质的结构了解生命现象。但即使通过晶体知道了蛋白质的结构，当它在体内或发生反应过程中，结构也可能发生变化，因此我感觉到结构与生命现象之间还存在很大的距离。所以开始苦恼是否应该这样研究下去，所以决定学习一种能观察更接近实际生命现象的动态状态的方法”。就在野田开始感叹利用NMR在溶液状态下分析蛋白质结构的方法时，稻垣研究室收到了东京工业大学的大隅良典特任教授提出的联合研究邀请。

大隅博士发现过很多与自噬有关的ATG基因，为阐明这些基因的功能，大隅博士邀请稻垣一起开展联合研究。野田在联合研究中负责调查ATG基因产生的Atg蛋白的结构。野田回忆说：“说来惭愧，直到开始进行联合研究，我都不知道自噬是什么。匆忙学习后发现这是一个非常有趣的现象，一下子就着了迷”。当时科学界虽然已经知道自噬与细胞器和蛋白质的分解及再生有关，但其机制几乎完全未知。此外，还涉及到很多基因，所以我觉得这是一个值得研究的生命现象。

搬运形成自噬体材料的蛋白质
内部是巨大的疎水性空腔

野田就这样开始了他的自噬的研究。氨基酸以链状合成的蛋白质具有由序列决定的固有立体结构，这种结构决定了功能。为明确当时几乎完全不了解的Atg蛋白的结构和功能，野田制作了Atg蛋白的晶体，试着分析了结构。很多Atg蛋白除了呈特定立体结构的区域外，还同时拥有无稳定结构、会不断变化的“固有无序区域”，所以很难结晶。野田通过去除固有无序区域成功制作了晶体，并接连确定了结构。

最后剩下的一个挑战是，Atg蛋白中体积最大的Atg2和唯一的膜蛋白Atg9。研究发现，Atg2会与脂质结合蛋白Atg18形成复合体，并与作为自噬体前体的隔离膜结合。然后在2017年利用电子显微镜分析发现，Atg2呈棒状，长约20纳米（纳米为10亿分之1米）。野田成功地使其部分结晶，2019年分析其结构证实，它的中心存在巨大的空腔。

这个空腔内部几乎全部由疎水性氨基酸构成，因此野田认为它会与脂质结合。于是尝试让空腔与磷脂的复合体进行结晶，结果野田的推测完全成立，磷脂结晶在空腔中。这表明，Atg2是负责从内质网提取形成自噬体所需的磷脂，并将其转运至自噬体的脂质转运蛋白（图2）。

图2：自噬体形成过程模式图。诱导自噬时，细胞质中会突然出现名为隔离膜的膜结构。隔离膜边包裹分解对象边伸展，最后关闭形成自噬体。隔离膜伸展所需的磷脂由Atg2从内质网供应，但光这样的话，脂质会堆积在隔离膜的细胞质层中，膜不会伸展。

另一方面，自噬体是由脂质双层膜构成的囊状器官。即使Atg2运来双层膜细胞质侧外层的磷脂，如果没有内层的脂质，也无法伸展双层膜。因此，野田着眼于作用未知的膜蛋白Atg9。为调查Atg9的结构，努力对其进行了结晶，但在很长一段时间里始终无法得到晶体。后来通过与参与CREST同一领域研究的东京大学研究生院医学系研究科的吉川雅英教授开展的联合研究取得了突破。利用吉川教授的专业冷冻电子显微镜确定了Atg9的立体结构。由此发现，Atg9与Atg2一样，也有疎水性空腔，野田认为Atg9可能具有转运脂质的功能。

野田利用体外的人工脂质膜证实了Atg9的功能，结果显示，Atg9具有在外层和内层之间转运脂质的功能（图3）。另外还证实，使形成含脂质的空腔的氨基酸发生突变后，酵母无法形成自噬体。野田说：“通过研究发现Atg2与Atg9相互协作形成自噬体。对于这种完全出乎意料的机理感到非常惊讶”（图4）。

图3：Atg9的结构与脂质加扰活性。Atg9形成三聚体，中心存在穿透膜的小孔，各个分子中存在与膜平行的小孔（a）。这些小孔相连，形成了脂质的通道。Atg9具有将脂质体外层的PI3P（一种磷脂）移动到内层的活性，但这种活性可以通过小孔的突变体抑制。黑点表示PI3P的分布（b）。

图4：通过Atg2和Atg9形成自噬体的脂质双层膜的情况。Atg2连接内质网膜和隔离膜，将内质网膜中所含的磷脂转运到隔离膜的细胞质层。Atg9与Atg2和Atg18一起局部存在于隔离膜顶端，通过将Atg2转运的磷脂移动到另一侧的层中，来实现隔离膜的伸展。

逆向思维成转机
通过相分离表达功能

野田多年来一直致力于从蛋白质的结构中了解其功能，但当他看到为了发表论文而绘制的模式图时，他意识到了蛋白质可能是通过固有无序区域聚集，从而表达其功能。野田说：“我一直想通过结构分析来明确蛋白质的功能，所以多年来始终忽略了碍事的固有无序区域。但后来，我换了一种想法，发现正是我认为碍事的区域对蛋白质发挥作用很重要”。调查发现，2009年德国的研究团队报告了特定的蛋白质在细胞内分离成与周围不同的液相并浓缩的“液-液相分离”的概念，之后，关于固有无序区域参与“液-液相分离”的报告接连出现。

在过去的研究中，大隅博士也发现，处于饥饿状态的酵母在形成自噬体前，Atg蛋白会聚集到一处，虽然功能未知，但大隅博士将其命名为“前自噬体结构（PAS）”。由于“液-液相分离”形成的液滴与PAS相似，因此野田决定通过“液-液相分离”的概念重新调查Atg蛋白。

出席会议结识联合研究人员
利用新分析方法取得成果

野田首先决定调查Atg蛋白是在什么状态下工作的。在观察其在细胞质中的状态时，以显微镜观察为主，而不是结构分析。虽然引入了荧光显微镜，但研究室里没有显微镜方面的专家。经过几天的反复试错，好不容易获得了基础数据。

通过数据可以确认，Atg13在营养丰富时与磷酸结合并分散开来，在暴露于营养缺乏的环境中时会去磷酸化，并聚集在液泡膜旁边，勉强维系周围的蛋白质，同时形成PAS（图5）。野田发现，这样形成的PAS会融合变成球形等，表现出液体的性质（图6a）。但是需要获得更准确的动态信息来证明这一点，所以考虑与显微镜专家进行联合研究。

图5：“液-液相分离”形成PAS的模式图。在营养丰富的条件下，Atg蛋白分散在细胞质中，与充满细胞质的各种蛋白质混合。当缺乏营养，Atg13去磷酸化时，Atg13会与其他Atg蛋白一起进行“液-液相分离”，在液泡膜上形成新的液相（液滴）。这些液滴就是PAS的本体，自噬体通过液滴形成。

与显微镜专家的邂逅是在JST主办的与其他研究团队进行交流的学习会上。野田说：“拥有最尖端生物成像技术的东京大学研究生院理学系研究科的冈田康志教授跟我说他对自噬感兴趣。从那时起，我们就一直在进行联合研究。”

在与冈田教授的联合研究中，利用荧光显微镜调查了细胞质中呈线状结构的Atg13的运动。由此证明，Atg13即使是在PAS内部时，也具有毫不逊色于在细胞质中时的运动性，也就是说，PAS是具有液体性质的液滴。

为了更详细地观察PAS内的Atg蛋白，野田还向在CREST的研究领域会议上结识的金泽大学纳米生命化学研究所的安藤敏夫特任教授提出了联合研究请求。野田说，他前往开发出高速原子力显微镜（高速AFM），拥有直接观察蛋白质动态的技术的安藤那里时，又结识了另一个人。他强调说：“我非常幸运，曾在安藤研究室做博士后的能代大辅正寻找下一个职位时，就邀请他来了我的研究室。正是因为他的到来，我们现在可以在研究室进行高速AFM观察。能操作最新设备的人才真的很重要。”

图6：利用荧光显微镜和高速AFM拍摄的液滴（PAS）图像。PAS在酵母细胞内融合变成球形的样子（a）。通过与Atg13融合的荧光蛋白的荧光观察。Atg蛋白液滴在巨大的脂质体膜上融合的样子（ｂ）。上面两张图片是Atg13的荧光图像，下面两张是微分干涉图像。高速原子力显微镜下的Atg蛋白液滴观察结果（ｃ）。可以看出，与Atg13一起促进液滴形成的S字型Atg17以随机方向存在于液滴中。图像进行了FFT带通滤波处理。

野田在试管内重建PAS并用显微镜观察到了与细胞内相同的相互融合现象（图6a、b）。接下来利用高速AFM观察重建的PAS，发现在PAS内部Atg蛋白以保持特征性结构不变的状态随机移动（图6c）。通过这种方式，野田在联合研究中利用最新的分析方法确定，Atg蛋白聚集进行“液-液相分离”形成的液滴是PAS的真实面目，“液-液相分离”直接控制自噬。

研究室内也进行跨领域融合
年轻研究人员带来新活力

野田发现的“液-液相分离”直接控制自噬的现象表明，之前一直偏重部分领域进行研究的“液-液相分离”其实与各种生命现象都有关。他就今后的研究计划表示：“‘液-液相分离’是一个非常有趣的现象。我们希望利用此前的发现，着手研究更高级的生命现象，比如睡眠和病毒感染等”。（研究中）通过加入“液-液相分离”的视角，为阐明此前未知的现象带来了希望。

研究室中的人才的多样性也是支持野田扩大研究的重要因素。据野田介绍，每次有新成员加入时，都会尽量避免专业领域重合，研究室里每天都在以跨领域融合的方式推进研究。野田说：“在这里，每个人都是各自领域的唯一专家。不仅能学习新知识，还可以发挥自己的经验，大家都干劲十足地投入到研究中。希望年轻的研究人员在不同领域进行积极尝试。”

随着引进新的分析方法和设备，研究迅速取得进展的情况并不少见。在各自的专业领域积累了经验和知识的年轻研究人员能为研究室带来新的活力，并可能催生出重要的研究成果。我们期待新一代自噬研究人员能跨越国界大展身手。

日语原文

文：JSTnews 11月号
翻译编辑：JST客观日本编辑部