最尖端的科学技术，正开始清晰地捕捉此前无法看到的身体和大脑的微观世界。本特集将介绍“时间精确定格冷冻光学显微镜法”——通过冷冻定格细胞的“决定性瞬间”，以高分辨率观察毫秒级的快速生命现象。此外，本文还将介绍利用光遗传学等技术阐明了负责记忆和识别他人的神经细胞的功能，探索了自闭症谱系障碍以及共情机制的奥秘，以及探寻人体全新可视化技术所开创的未来。
自16世纪后期光学显微镜发明以来，人类得以观察到此前因尺寸太小而无法看见的事物，科学由此取得了巨大发展。此后，根据不同的目的，各种类型的显微镜被相继开发出来，时至今日，开发的热情丝毫未减。大阪大学研究生院工学研究科的藤田克昌教授在全球首次开发出的“时间精确定格冷冻光学显微镜法”，能够在目标时间点瞬间停止细胞活动并进行观察，有望在生命科学、医疗及新药研发等众多领域得到应用。
藤田克昌
大阪大学研究生院工学研究科教授
2019～2024年 CREST研究负责人
让细胞停止活动，在弱光下仔细观察
转换研究思路，兼顾定量性和分辨率
生物细胞内部的状态每时每刻都在发生变化。为了观察细胞是如何活动的，研究人员为了捕捉其真实面貌，一直在不断挑战。凭借光学显微镜这种“最强武器”之一，迄今为止已阐明了多种生命现象。
荧光显微镜作为光学显微镜的一种，被广泛运用于在分子水平上观察细胞内部的状态。它通过检测样本在光照下发出的荧光，来可视化分子的状态。其优点是可以高对比度地选择性观察目标；但另一方面，为提升时间分辨率而缩短光照时长，会导致可检测到的荧光量下降，进而出现定量性和空间分辨率下降的问题。
在细胞内，离子浓度的变化以毫秒（ms，毫为千分之一）为单位传递。为了捕捉瞬间的状态变化而缩短光照时间，会导致样本发出的光量不足，画面充满噪声。另一方面，如果为了弥补光量不足而使用激光等强光，又会因高温造成细胞死亡。
也有使用福尔马林或酒精类化学试剂停止细胞活动后进行观察的方法。但停止活动需要数分钟以上的时间，很难观察到特定瞬间的细胞状态。此外，使用化学试剂还存在会导致细胞状态和离子分布发生变化的问题。
观察特定瞬间细胞的真实状态——说起来简单，但此前一直存在难以逾越的技术壁垒。为了解决这一课题，许多研究人员致力于开发拍摄速度更快的显微镜，但大阪大学的藤田克昌教授却转换了思路。他设想，如果能够瞬间停止细胞的活动，之后即使用弱光也可以长时间仔细观察，这样不就能兼顾时间分辨率和空间分辨率了吗？
向样本直接滴加液体冷冻剂
瞬间冻结细胞后进行观察
藤田教授为停止细胞活动，选择的是冷冻样本的方法。然而，要将含水量高的细胞以原有状态进行冷冻并非易事。最大的阻碍是冰晶。水在冻结时会形成尖锐的结晶，从内外破坏细胞。
作为一种不损伤细胞微细结构即可实现冷冻的方法，可以使用极低温液体冷冻剂。
使用液化气体丙烷或异丁烷等液体冷冻剂对细胞进行急速冷却时，水分子在规则排列之前就以随机状态冻结。这样细胞内就不易形成冰晶，可以在不破坏细胞的情况下将其冷冻。
然而，这一尝试并非一帆风顺。最初，研究人员是先在别处冷冻细胞样本，然后再移送至显微镜载物台观测，但实验并不顺利。因为在细胞样本的移动过程中，即使能将样本保存在液氮中的极低温环境，在放到显微镜载物台上时也依旧不可避免地会升温。只要样本温度稍有上升，细胞的一部分就会融化，水分子移动从而形成冰晶。此外，空气中的水分也会瞬间冻结，形成冰霜覆盖样本。
在反复试错的过程中，藤田教授某天意识到“样本先冷冻后再转移至显微镜”这一固有认知束缚了研究。他萌生了全新构想：在显微镜下观测细胞的同时直接急速冷冻细胞。
于是，研究团队将盛放细胞样本的容器（样本室）放置在载物台上，开发了一种将液体冷冻剂直接滴加到样本上的装置，成功开发出了瞬间冷冻样本细胞并进行观察的方法（图1）。液体冷冻剂采用-185℃的液态异戊烷和液态丙烷混合物。盛放样本的样本室选用了即使在滴加液体冷冻剂的瞬间承受急剧温差也不会破损、且易于保持低温的材料，用3D打印机自制而成。只要准备好备用的样本室，更换观察样本仅需约1分钟。
图1 为在显微镜载物台上急速冷冻细胞样本而开发的样本室截面图及实物照片。在滴加-185℃的液态异戊烷和液态丙烷混合而成的液体冷冻剂之前，先用移液器减少缓冲液，以提高样本的冷却效率。
此外，通过电动控制，可以以±10ms的精度将液体冷冻剂滴加到样本上，在指定时间点冻结细胞。“时间精确定格冷冻光学显微镜法”由此诞生，它能够根据需要定格细胞的时间，然后长时间仔细地进行观察。“冷冻（Cryo）”源自希腊语，意为“冰”、“低温”。
对瞬间活动可观察长达10秒
拍摄细胞内传导的Ca2+
藤田教授等人利用该装置，成功地对大鼠心肌细胞内高速运动的钙离子（Ca2+）以及细胞内动态运动的细胞器等进行了瞬间冷冻固定及观察。Ca2+在细胞内承担着传递各种信号的作用，其浓度随细胞活动而变化。由于Ca2+运动速度极快，既往观察方法只能照射短短10ms的光线。
藤田教授等人使用开发的装置对大鼠心肌细胞进行急速冷冻后，Ca2+的运动如期停止（图2）。以往转瞬即逝的细胞活动，现在可以照射长达10秒的光进行观察，观测时长是既往方法的1000倍。结果，代表图像清晰度的信噪比从8.9提升至340，获得了分辨率极高的图像（图3）。此外，研究还证实，从细胞内现象发生到冷冻固定的时间可以以±10ms的精度任意设定。
图2 Ca2+在大鼠心肌细胞内传导的过程。为进行拍摄，向细胞内导入了在Ca2+浓度高时会发光的荧光性Ca2+指示剂。常温下Ca2+从图像左上向右下高速传导，但投入液体冷冻剂进行冷冻固定后传导停止（右二），200ms后依然维持该状态。
图3 常温下曝光10ms拍摄的图像（左）与冷冻固定后曝光10s拍摄的图像（右）。冷冻固定后，拍摄时长较常温时提升1000倍以上，因此可获得噪声更低、更清晰的图像，实现定量性更高的观察。
利用此次开发的“时间精确定格冷冻光学显微镜法”，就能够针对同一时间点的细胞状态，借助多种所需观测时长各不相同的光学显微镜技术进行详细观察。通过对随时间推移分布和状态发生动态变化的细胞生命现象和细胞响应进行高定量性、高空间分辨率的可视化，“或许能够为生命科学、疾病机制的阐明和药物研发带来全新见解”——藤田教授对此寄予厚望。
同样应用于“拉曼显微镜”
实现既往方法8倍的亮度
藤田教授等人还在推进将生物样本急速冷冻的方法与各类显微镜相结合的相关研究。拉曼显微镜便是其中之一。它通过检测照射光被样本分子反弹时产生的“拉曼散射光”，来可视化样本中所含分子的种类和结构。
由于拉曼散射光极其微弱，想要检测低浓度物质或提高信噪比，就需要对生物样本照射强激光。但这样做可能会使样本损伤或改变其状态，因此过去普遍认为不适用于细胞观察。
藤田教授从20多年前就开始从事拉曼显微镜的开发，致力于提升测量的灵敏度和速度。他还曾参与大阪大学创办的初创企业Nanophoton（大阪府箕面市），将自主开发的拉曼显微镜产品化。通过将在此积累的技术与细胞急速冷冻观察技术相结合，开发出了适用于细胞观察的“冷冻-拉曼显微镜”（图4）。在抑制样本损伤和状态变化的同时，实现了利用拉曼显微镜对细胞进行观察。
图4 “冷冻-拉曼显微镜”的样本周边示意图。将培养有细胞的盖玻片放置在样本架上，并接触金属板。注入的液体冷冻剂通过金属板的孔接触样本，使细胞急速冷冻。通过流经金属板内部的液氮和加热器进行精密温度控制，使细胞保持稳定状态，也不易发生热引发的分子振动。
“冷冻-拉曼显微镜”通过耗时收集微弱的拉曼散射光，能够以比既往方法更高的灵敏度检测细胞内的分子。实验证实，与既往方法相比，可获得约8倍的拉曼散射光（图5）。
图5 用“冷冻-拉曼显微镜”观察冷冻固定的培养细胞的图像。观察时长约10小时。图像中绿色表示细胞色素，红色表示脂质，蓝色表示蛋白质的分布。
使用拉曼显微镜进行观测时无需对样本进行染色，能够直接可视化细胞未发生状态与功能改变时的原始样貌。藤田教授满怀期待地表示：“以往的观察是对预先标记好的‘目标观察对象’进行确认的操作，而我们开发的“冷冻-拉曼显微镜”能够非破坏性地读取样本整体的信息。所得数据中，或许隐藏着意想不到的发现”。
为了解“活细胞”学医
真实“描绘”生命的姿态
藤田教授运用各种光学现象，致力于开发让原本不可见的事物变得可见的显微镜技术，但他并非从一开始就立志研发显微镜。他笑着回忆道：“我在确定毕业论文课题的讨论会时迟到了，剩下可选的课题恰好就是显微镜”。当时的主流方向是将具有高能量的电子束照射到样本上进行观察的电子显微镜。然而，藤田教授通过巧妙调控光的波长与特性，逐渐沉浸于电子显微镜无法实现的“活细胞所蕴含的信息”的观察。
博士结业后，为了加深对观察对象——“活细胞”的理解，他以博士研究员的身份进入京都府立医科大学的病理学教研室。由于他此前一直在工学部从事研究，几乎没有医学知识，那段日子可谓艰苦卓绝。他回顾道：“完全看不懂论文的内容，读完一篇论文需要花费很长时间。感觉就像回到了大学一年级”。
然而，通过亲自培养细胞进行实验，他积累了只有通过实践才能获得的经验，也逐渐理解了生物学家和医生们出于何种理由、想要观察什么以及希望如何观察。进而也明白了为了满足这些需求，需要开发什么样的显微镜。
在全球顶尖研究人员激烈角逐的环境下，藤田教授没有追随聚集大量研究人员与资金的热门研究课题，而是坚持以独到视角开拓全新研究领域的立场。以急速冷冻活细胞、捕捉“决定性瞬间”这一独特思路，力求生动还原生命的真实样貌，其背后的驱动力，正是“究竟能看见什么”的好奇心，以及敢于质疑并突破常识与固有认知局限的自由思维。
（TEXT：安藤鞠、PHOTO：松井Hirosi）
原文：JSTnews 9月号
翻译：JST客观日本编辑部
