日本理化学研究所（以下简称“理研”）放射光科学研究中心的香村芳树组长等人组成的国际联合研究团队全球首次成功开发出了X射线区域的高分辨率光片显微镜（光片显微镜）。它的性能优于可见光区域的光片显微镜，有望为阐明脑神经网络的三维结构等做出贡献。相关成果已发布在Scientific Reports上。
图1：X射线光片显微镜的构成与光片厚度测量结果（供图：理化学研究所）
a）X射线光片显微镜的构成。利用全反射镜反射X射线束并沿垂直方向聚拢，形成细长的光片。用光片照射包含发红色和绿色光的微小闪烁体的样本，然后利用可见光显微镜系统从垂直于X射线光轴的方向观察这些发光。可以使用彩色滤光片区分并观察不同波长的发光。样本沿淡蓝色箭头的方向平移。
b）光片的厚度。从X射线聚焦点出发，以几条路径沿光轴方向移动的同时进行刀口测量。横轴表示X射线光轴方向的位置，纵轴表示光片厚度方向的位置，在这些坐标的各个点测量的X射线强度用亮度表示。
c）X射线沿b中的红色箭头和淡蓝色箭头的一维强度分布。FWHM为半峰全宽。
近年来，使用X射线的三维成像精度提高，被广泛应用于各个领域。其中常用的是通过X射线的吸收和相位获得对比度的X射线计算机断层扫描法（CT法）和通过散射获得对比度的相干X射线衍射显微镜法。这些方法需要旋转样本进行测量，并通过计算求取三维信息，所以在获取大样本的三维信息时，由于以高分辨率观察时视野会变窄，需要拼接数据，使得计算变得复杂。另外，对于1厘米左右的大型生物样本中的微小组织，导入10纳米左右的金等微粒标记物进行观察时，还存在难以获得对比度的问题。
作为无需旋转样本即可观察断层图像的方法，研究人员开发了可见光区域的光片显微镜。光片显微镜设置了从样本侧面照射片状激发光（光片），在与光片垂直相交的方向观察样本中的荧光材料分布的显微镜系统。通过使样本垂直于光片平移，无需计算即可获得三维信息。由于仅向进行荧光观察的显微镜对焦的面照射光片，可以避免失焦图像在其他面重叠以及观察面以外的额外辐射损伤。然而，会存在样本进深方向的分辨率低于面内方向分辨率的课题。
在可见光光片显微镜中，如果将决定进深方向分辨率的光片厚度降至1微米以下，就需要先进的技术。另一方面，面内方向可以轻松达到200纳米左右的分辨率，结合使用超分辨率显微镜技术的话还能进一步提高，这样进深方向与面内方向的分辨率之间的不对称性会变得更加明显，导致易用性变差。
作为SYNAPSE（Synchrotrons for Neuroscience - an Asia-Pacific Strategic Enterprise）项目的一部分，国际联合研究团队开发了有望大幅减薄光片厚度的X射线区域的光片显微镜。
国际联合研究团队在SPring-8的理研光束线中构建了高分辨率三维成像用X射线光片显微镜。构建的X射线光片显微镜通过用全反射镜将X射线聚拢成片状，利用刀口测量法确认光片的最小厚度为65纳米。而且，使用20倍镜头时，即使是显微镜的视野（600微米见方）边缘，厚度也小于300纳米。另外，向样本中导入随着X射线发光的闪烁体微粒后，结果显示，可以通过宽视场的薄截面图像进行样本进深方向分辨率较高的三维成像测量。此次使用的全反射镜适合将X射线聚光到最小尺寸，而且没有色差。因此，无需将来自光源的非常强的X射线单色化，即使直接照射到样本上，聚光尺寸（X射线光片的厚度）也仍然很小，有利于高速三维成像测量。
国际联合研究团队将此次开发的X射线区域光片显微镜命名为MAXWELL（Microscopy by Achromatic X-rays With Emission of Laminar Light）显微镜。
MAXWELL显微镜将X射线用微荧光材料（尺寸为10～20纳米的闪烁体）导入样本中作为标记物，仅照射光片的非常薄的截面产生荧光。利用与X射线光轴垂直相交的可见光用显微镜来观察荧光材料的二维分布，通过使样本沿光片厚度方向移动的同时拍摄图像来获得三维分布。
为调查MAXWELL显微镜的分辨率，研究团队制作了在微细图案上附着20纳米左右的量子点微粒的样本。观察结果显示，可以分辨距离约为400纳米的微粒，因此面内方向的分辨率约为400纳米，达到了衍射极限。另外还确认，进深方向的分辨率约为70纳米。这些结果表明，与可见光光片显微镜（进深方向的分辨率为数百纳米至1微米左右）相比，MAXWELL显微镜的分辨率在进深方向具有压倒性优势，面内方向也达到了衍射极限。
在生物样本的三维观察中，厚度为数十微米以上时需要进行透明化处理，但比这个厚度薄的话则不需要透明化处理。
MAXWELL显微镜面内方向的分辨率为达到衍射极限的400纳米左右，今后通过用超分辨率显微镜法将其提高10倍左右，预计可实现各向同性高分辨率三维成像。另外，通过使用低噪声相机，可以获得单分子成像实验所需的性能，作为SYNAPSE项目主要研究对象的脑神经网络的三维结构等有望取得划时代的科学发现。
原文：《科学新闻》
翻译编辑：JST客观日本编辑部
【论文信息】
期刊：Scientific Reports
论文：The new X-ray/visible microscopy MAXWELL technique for fast three-dimensional anoimaging with isotropic resolution
DOI：10.1038/s41598-022-13377-w
