京都大学研究生院工学研究科的浜地格教授（研究当时职称，现为该校能源理工学研究所特任教授）、田村朋则副教授、Fatima Yuri Tanimura Valor博士生等人，着眼于能够穿过细胞膜的单线态氧，利用固定在细胞外侧的光敏化剂所产生的单线态氧，开发出了同时标记膜蛋白细胞内外邻近蛋白的transmembrane PhoxID（tmPhoxID）新技术。研究团队将该技术应用于活体小鼠脑内的神经递质受体后，成功鉴定了受体周围存在的蛋白质群，并发现了通过突触连接神经细胞间的分子网络以及此前未知的相互作用。作为一举解析膜蛋白细胞内外分子网络的全新研究基础，有望广泛应用于神经科学等生命科学研究。相关成果已发表于《Nature Communications》。
图1 tmPhoxID的原理（供图：京都大学）
首先，使用纳米抗体或小分子探针将光敏化剂靶向至靶跨膜蛋白的细胞外区域。随后，在膜透过性生物素标记剂存在下，照射绿色光（520nm）激发光敏化剂，产生单线态氧（¹O₂）。¹O₂穿过脂质双层膜，氧化跨膜蛋白细胞内外的邻近蛋白。这些被氧化的邻近蛋白与生物素标记剂反应，从而被生物素修饰。将生物素修饰的蛋白质用亲和素磁珠纯化、浓缩，制成肽片段后，进行质谱分析，即可鉴定邻近蛋白质。
此前，解析跨膜蛋白质相关分子网络时，广泛采用将免疫沉淀与质谱分析相结合的IP-MS法，但其空间分辨率和时间分辨率不足，难以捕捉局部、瞬时发生的相互作用。因此，邻近标记法被广泛使用，但所用的高反应性分子大多无法穿透细胞膜，所以只能解析细胞内外某一侧的相互作用蛋白。
研究团队应用此前开发的PhoxID，确立了能够跨越细胞膜进行邻近标记的tmPhoxID新方法。tmPhoxID首先使用低分子抗体（纳米抗体）或小分子探针，将光敏化剂靶向至靶跨膜蛋白的细胞外区域。随后照射绿色光（520纳米）激发光敏化剂，产生单线态氧。单线态氧寿命短（半衰期约数百纳秒）、扩散性极高，能够跨越脂质双层膜，因此可选择性地氧化跨膜蛋白细胞内外的邻近蛋白。这些被氧化的蛋白质被膜透过性高的生物素标记剂修饰，并进行质谱分析，即可系统性鉴定靶跨膜蛋白细胞内外的邻近蛋白。
研究团队将新开发的tmPhoxID应用于活体小鼠脑内，调查神经细胞表达的各种神经递质受体周围富集的蛋白质。将该技术应用于定位于小脑兴奋性突触后膜的GluD2受体后，除GluD2的细胞外相互作用蛋白之外，还检测到了已知与GluD2特异性相互作用的细胞内（突触后膜内）蛋白质。此外还发现，突触前侧与神经递质释放相关的细胞内蛋白质也能被检测出来。
该结果显示，该技术有望全面检测近年来作为高效进行突触传递的机制而提出的“跨突触纳米柱”的构成蛋白。
接下来，研究团队将tmPhoxID应用于定位于抑制性突触后膜的GABAAR。结果显示，与靶向定位于兴奋性突触后膜的GluD2的实验不同，检测到了定位于抑制性突触的细胞内蛋白质群，表明tmPhoxID具有突触级别的空间分辨率。此外，通过比较同一兴奋性突触中存在于不同位置的GluD2与mGlu1，发现tmPhoxID能够区分非常邻近位置上的蛋白质差异。
此外，分析GABAAR周围存在的蛋白质后，发现了此前未知的GABAAR与CAMKV蛋白质之间的相互作用。该相互作用不仅在小鼠脑中，在人类死后大脑中也得到确认。GABAAR与CAMKV的相互作用在神经科学上具有怎样的功能和意义尚不清楚，今后将进行更详细的探讨。
田村副教授表示：“本项目始于此前推进PhoxID开发的高远同学在毕业前观测到一个意料之外的结果——反应似乎跨越了细胞膜。之后的研究曾一度难以重现结果、进展停滞，但来自西班牙的留学生Tanimura坚持研究，找到了最合适的生物素化剂，之后研究才得以快速推进，最终顺利完成论文。”
原文：《科学新闻》
翻译：JST客观日本编辑部
【论文信息】
期刊：Nature Communications
论文：Transmembrane PhoxID: Photoproximity labelling across the plasma membrane in vivo
DOI：10.1038/s41467-026-78135-2
