日本国立研究开发法人产业技术综合研究所（以下简称“产综研”）与日本触媒股份公司合作，利用产综研确立的检测灵敏度为以往方法500倍的高灵敏度同位素示踪法，发现了多种能分解石油化工废水中有害物质1,4-二恶烷的微生物，同时还确认，这些微生物可以通过相互协作来维持稳定的分解。
1,4-二恶烷是一种对人类可能有致癌性的有害物质，全球都在加强监管。近年来备受关注的1,4-二恶烷处理方法是低成本、低环境负荷型生物处理，但此前1,4-二恶烷分解菌只能通过费时费力的分离培养法调查，因此只知道为数不多的几种分解菌。此次，研发小组利用产综研确立的不依赖分离培养法的高灵敏度同位素示踪法，从石油化工废水的生物处理槽中发现多种1,4-二恶烷分解菌，并且发现这些分解菌能通过相互协作来稳定去除1,4-二恶烷。
此次的成果已于2018年6月13日在线发布于自然出版集团（Nature Publishing Group）出版的微生物生态学领域的学术杂志《The ISME Journal》。
开发的社会背景
1,4-二恶烷是石油化学产品制造过程（图1A）中的副产物，是一种人工化学物质，还广泛用作氯化溶剂的稳定剂。国际癌症研究机构（IARC）和美国环保署（US EPA）指出1,4-二恶烷对人类可能有致癌性，全球强化了1,4-二恶烷的环境标准和废水标准。
近年来，作为1,4-二恶烷的处理方法，低成本、低环境负荷型生物处理备受关注。但1,4-二恶烷分解菌此前只能通过费时费力的分离培养法调查，存在信息不足的情况。即使是能稳定处理石油化工废水的生物处理槽（图1B），也完全不清楚1,4-二恶烷分解菌的实体，长期以来一直是评估和控制生物处理过程的一大课题。
图1：石油化学工业的（A）产品制造工厂和（B）工业废水的生物处理槽
研究内容
日本触媒公司内设置的生物处理槽中的活性污泥由数千～数万种微生物构成，此次研发小组利用产综研确立的高灵敏度同位素示踪法对其进行了分析。自然界中的大部分碳为12C（质量数为12），因此把利用稳定同位素碳13C（质量数为13）合成的13C标记1,4-二恶烷加入活性污泥中，震荡8小时（图2）后，13C标记1,4-二恶烷减少，同时生成了13 CO2。接下来，从活性污泥中提取微生物核糖核酸（RNA），然后高速旋转装有样品的试管，实施超速离心分离。进行超速离心分离后，由碳12C构成的较轻RNA分子会留在试管上部，而试管下部聚集了包括源自13C标记1,4-二恶烷的同位素碳13C在内的较重RNA分子。由此确认，1,4-二恶烷被活性污泥中的微生物分解，而且分解的碳的一部分成为微生物的生物成分。
研发小组将试管下部分成3部分进行收集，利用新一代定序器对100多万个微生物RNA分子进行解析发现，9种微生物（A～I菌）获取了源自1,4-二恶烷的同位素碳13C（图3）。其中1种（H菌）与已知的1,4-二恶烷分解菌Pseudonocardia dioxanivorans相同。但其他8种1,4-二恶烷分解菌分别携带各不相同的多种基因信息，此前并没有能分解1,4-二恶烷的报告，此次利用高灵敏度同位素示踪法首次发现这些菌类具备分解功能。另外，从微生物RNA分子的重量差异中发现，仅在RNA分子最重部分和第二重部分发现（或者检测到）的4种分解菌（F、G、H、I菌）只利用分解1,4-二恶烷获得的微量能源生存，其余5种分解菌（A、B、C、D、E菌）除1,4-二恶烷外，还利用共存的化学物质（单乙二醇和烷烃类等）进行共同代谢。
图2：高灵敏度同位素示踪法的概要
图3：此次利用高灵敏度同位素示踪法发现的1,4-二恶烷分解菌
研发小组在2015年5月至2016年4月的约1年时间里，详细追踪了日本触媒公司内实际设置的生物处理槽中的1,4-二恶烷分解菌的动态（图4）。此次确定的1,4-二恶烷分解菌都是年均相对丰度为0.001％～1.523％的稀有微生物，随着1,4-二恶烷的去除率而变化。从分解菌中相对丰度较大的5种菌（A、B、C、D、I菌）的变化来看，在夏季（7～8月）去除率急剧降低时，全部5种1,4-二恶烷分解菌均减少，但随后D、C菌开始增加，去除率立即恢复。由于定期维护，系统会停运约1个月，在维护结束重新投入运转后的秋季（10月）的去除率恢复期，首先C菌会暂时增加，然后再减少，接下来A、D、B菌会增加来弥补C菌的减少，从而恢复去除率并保持稳定的分解。在初春（3～4月）的去除率降低期，B、C、I菌会增加，以防止去除率显著降低。如上所述，实际的生物处理槽内的1,4-二恶烷分解菌分别显示出了不同的变化模式。这表明，这些分解菌是通过相互协作来稳定去除石油化工废水中的1,4-二恶烷的。
图4：石油化工废水的生物处理槽中的1,4-二恶烷去除率和分解菌的变化
文 客观日本编辑部
