京都大学研究生院工学研究科的浜地格教授、田村朋则讲师、高远美贵子博士研究生（研究当时）等人开发出了一种可以分析活体动物脑内突触中神经递质受体附近存在的蛋白质的新方法。该方法被命名为“PhoxID法”，由于无需进行基因重组等操作，能够在更加自然状态下获得蛋白质相互作用的图像。研究团队利用这种方法不仅揭示了小鼠脑内AMPA受体中存在的外周蛋白随年龄变化的情况，还发现了一些此前未知的变化。田村讲师表示：“理论上这种方法可适用于以所有蛋白质为目标的邻近蛋白质分析。该技术关键的光敏剂可以在生化实验室中轻松合成，因此我们希望该技术能被更多的人使用，所以未申请专利。”该研究成果已发表在期刊《Nature Chemical Biology》上。
田村朋则讲师（供图：京都大学）
明确神经递质受体的蛋白质-蛋白质相互作用网络（相互作用组）对于理解复杂的大脑功能，如记忆和学习等至关重要。然而，传统方法仍存在一些问题。比如，用于邻近标记的抗坏血酸过氧化物酶（APEX）具有毒性，因此很难在活体内应用；生物素连接酶（BioID/TurboID）则必须连续7天向活体小鼠投用生物素化试剂。此外，这两种方法都依赖于基因重组来表达复合蛋白，操作对蛋白质三级结构和相互作用的影响令人担心。
图1 使用PhoxID法进行的神经递质受体相互作用组分析（供图：京都大学）
在PhoxID法中，研究团队首先使用了独特的蛋白质化学修饰技术（配体定向化学）来修饰与目标受体结合的光敏剂。以AMPA受体为靶受体时，研究团队制备了一种在酰基咪唑上结合AMPA配体“PFQX”，并在另一侧附着单溴荧光素（MBF）的光敏剂。将这种物质引入侧脑室后，会在脑内广泛分布。当绿光（波长520nm）通过光纤照射到待分析区域时，会在光敏剂的作用下生成单态氧，并氧化外周蛋白。用酰肼连接脱硫生物素标记剂修饰这些氧化的蛋白质，并进行质谱分析，即可全面识别受体相互作用组。“单线态氧在几百纳秒内就会消失，所以蛋白质可以扩散的距离只有几十纳米。只能氧化目标的周围。”（田村）
研究团队在小鼠海马区对AMPAR和GABA0404A受体实施PhoxID法后，发现该方法仅需1～10分钟的光照时间，就能成功识别出包括已知的相互作用蛋白在内的多个受体相互作用组。此外，当光照部位改为小脑时，还检测到了已知的小脑特异性AMPAR相互作用蛋白。
此外，研究团队还利用更高的时间分辨率追踪了AMPAR相互作用组在出生后发育过程中的变化。将PhoxID法应用于8日龄、13日龄和5周龄小鼠的小脑，并进行定量质谱分析，发现随着小鼠的生长，许多蛋白质的标记强度有增强的趋势。这与伴随脑部发育AMPAR的表达量增加，形成了更多的神经回路有关。另一方面，研究还发现一些蛋白质的标记强度在13日龄小鼠中达到最高，在5周龄小鼠中显著降低。
研究人员通过蛋白质印迹（Western Blot）分析发现，多种细胞粘附分子的表达量降低，还通过免疫染色发现，在8日龄时，细胞粘附因子NECTIN3在小脑浦肯野细胞中远离AMPAR的位置表达，而在13日龄时与AMPAR共定位。
通过PhoxID法，研究团队首次揭示了AMPAR和NECTIN3在小鼠小脑中存在幼年期特异性接近的现象。该现象在神经科学上的意义尚不清楚，更详细的研究将为神经科学提供新的知识和见解。
只要受体的亲和性配体或抗体可用于研究，PhoxID法理论上可适用于所有蛋白质、所有生物体，因此今后有望应用于更广泛的受体。此外，进一步将该方法与基于行为学和光遗传学的细胞水平功能分析技术相结合，预计有助于阐明高级脑功能的分子机制。
原文：《科学新闻》
翻译：JST客观日本编辑部
【论文信息】
期刊：Nature Chemical Biology
论文：Photoproximity labeling of endogenous receptors in the live mouse brain in minutes
DOI：10.1038/s41589-024-01692-4
